Особенности цифровой микроскопии


    Цифровая микроскопия в отличие от традиционной световой микроскопии дает возможность помимо непосредственно наблюдения объектов на экране монитора, документировать информацию в электронном виде, т.е. делать цифровые фотоснимки, а также записывать видеоролики.

    Технически вместо окуляра светового микроскопа с помощью специального адаптера размещается специальная цифровая видео камера высокого разрешения. Важно, чтобы камера была «быстрая», то есть отображала информацию на экране без торможения и практически без задержки.

Коллаж_1    Классический световой микроскоп состоит из объектива и окуляра. Объектив увеличивает размер наблюдаемого объекта, а окуляр «рассматривает» уже увеличенное объективом изображение, направляя в глаз параллельный пучок света. Таким образом, ОПТИЧЕСКОЕ увеличение светового микроскопа — это произведение (перемножение) увеличения объектива и окуляра. Например, объектив увеличивает в 40 раз, а окуляр — в 10 раз, тога суммарное увеличение микроскопа 400 раз.

    В случае цифрового микроскопа роль глаза человека играет камера, а роль сетчатки глаза, куда проецируется изображение, играет светочувствительная матрица камеры. Изображение, сфокусированное на матрицу камеры транслируется на экран монитора. И уже с экрана монитора мы можем видеть картинку непосредственно своими глазами. Таким образом, первоначально роль человеческого глаза как приемника оптической информации играет камера. Тогда по аналогии с оптическим увеличением, визуальное увеличение на экране монитора есть произведение (перемножение) увеличения объектива и собственного увеличения камеры. Например, если объектив имеет увеличение 40х, а собственное увеличение камеры 50х, то общее визуальное увеличение на экране монитора выходит 2000х.

    Не следует путать визуальное увеличение на экране монитора с оптическим увеличением микроскопа. Увеличение микроскопа в первую очередь определяется объективом микроскопа. Объектив имеет такую характеристику как числовая апертура. Величина числовой апертуры указывается на самом объективе через слэш после увеличения. Например, если на объективе указано 100/1.25, это значит, что числовая апертура данного объектива порядка 1.25. Так вот максимально достижимое полезное оптическое увеличение микроскопа равно тысячекратно взятой числовой апертуре, т.е. в нашем примере — 1250 раз (для данного объектива). Данная величина ограничивается фундаментальными законами дифракции света и не может быть изменена существенно для видимого диапазона света (весь спектр радуги).

    Может возникнуть вопрос, как же цифровыми методами визуализации достигается увеличение большее, чем 1250 раз (для 100х  объектива). Например, если визуальное увеличение на экране Вашего монитора составляет 4000 раз (для 100 объектива), это значит, что изображение на матрице камеры проецируется с некотором запасом пикселей по разрешению, чтобы все малейшие объекты и детали были как можно более мелко запечатлены. Т.е. микроскопическая точка, разрешенная объективом, проецируется не на один пиксель матрицы камеры, а на три или четыре, что позволяет его лучше визуализировать и рассмотреть. Таким образом, наблюдая объекты на экране монитора с высоким визуальным разрешением, даже находясь на каком-то расстоянии от него, наблюдатель можно точно зафиксировать данную микроскопическую точку. А вот если бы эта точка наблюдалась просто в окуляры светового микроскопа, то, ввиду ее микроскопичности, она могла бы выскользнуть из виду. Ну, или, по крайней мере, нужно было бы прикладывать немалые усилия, стяжать зрение наблюдателя, чтобы зафиксировать визуально данный микроскопический объект.

    Таким образом, надбавочное увеличение (все что сверх полезного оптического увеличение) позволяет просто комфортно и более точно фиксировать мелкие объекты с помощью цифровых систем визуализации. Таким образом, например, «прыгающие точки» (липиды, бактерии) в плазме крови, которые с трудом видны в окуляры простого светового микроскопа, удается без труда фиксировать цифровыми методами визуализации в микроскопии.

    Однако же, надо понимать, что если мы с помощью цифрового проектора сфокусируем изображение на стену дома, и получим визуальное увеличение, допустим в 100 000 раз, это не значит, что мы увидим какие-либо новые мелкие объекты. Рассматривая эритроциты крови, мы не увидим на стене их «ручек-ножек-глазиков». Надбавочное увеличение не открывает новых деталей, оно лишь позволяет более удобно визуализировать исследуемые объекты. А слишком высокое надбавочное увеличение ведет к уменьшению четкости и контраста. Данный пример с проецированием на стену может быть актуален только если наблюдатель находится на большом расстоянии от стены.

    Вообще говоря, платой за удобство наблюдения является уменьшение четкости и контраста. Никуда отсюда не денешься. Чудес не бывает (бывают, но не здесь). Надбавочное увеличение является полезным только в небольшом количестве. При условии наблюдения исследуемого объекта на расстоянии одного метра от монитора, допустимое полезное надбавочное увеличение должно быть не более 4-5 раз больше полезного оптического увеличения. То есть, если используется объектив 60х с апертурой 0.85 (полезное оптическое увеличение при этом будет 850х), то визуальное увеличение на экране монитора не должно превышать 4000-5000 раз. На практике собственное увеличение камеры для монитора 15″ (16:9) варьируется в пределах 40х…60х (в зависимости от модели камеры и форм-фактора матрицы), соответственно визуальное увеличение на экране монитора для объектива 60х будет соответственно 2400х … 3600х.

    Есть еще один нюанс. С возрастанием увеличения микроскопа уменьшается поле зрения. Вообще величина поля зрения и увеличение микроскопа — обратно пропорциональные величины. То есть если мы хотим хорошо видеть мелкие детали объекта исследования, тех же, например, эритроцитов при 100х объективе, то при этом мы будем видеть на экране всего 3-5 штук эритроцитов. Но они будут большие, хорошо детализированы. И наоборот, если эритроциты маленькие, например, при наблюдении с объективом 10х, то их может поместиться на площади экрана порядка 300-500 штук, тогда мелких деталей каждого эритроцита конечно же не видать, зато можно увидеть общую картину расположения эритроцитов по капле крови, скопления, конгламераты, различные включения и проч.

    Таким образом, при работе с цифровым микроскопом следует так подобрать увеличение путем смены объектива микроскопа, чтобы общее визуальное увеличение на экране монитора было достаточно высоким для разрешения мелких деталей эритроцитов, но поле зрения при этом должно оставаться достаточно широким для наблюдения ситуации в целом по протяженности исследуемого объекта. Например, для микроскопии нативной крови при наблюдении ситуации в целом используется объектив 10х или 20х, а для исследования структуры форменных объектов крови (эритроциты, лейкоциты, включения и проч.) очень хорошо зарекомендовал себя объектив 60х. Если нужно получить детальное исследование отдельных объектов, тогда используют иммерсионный объектив 100х. Другой популярный объектив, который стандартно поставляется с микроскопами, 40х в микроскопии нативной крови являет собой некий компромисс между разрешением и большим полем зрения. Но для структурного анализа его увеличения все же недостаточно.

    Пробуйте, экспериментируйте, у Вас все получится!!

См. также статью Как определить визуальное увеличение цифрового микроскопа.


© Любая часть авторских материалов, размещенных на данном ресурсе, может быть перепечатана только с обязательной ссылкой на источник. ©